體外哺乳動物細胞TK基因突變試驗方法及導則

TK基因突變試驗的檢測終點是TK基因的突變。TK基因突變屬于常染色體基因突變。TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反應。在正常情況下，此反應并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應生成TMP。但如在細胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進而摻入DNA，造成致死性突變,故細胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻DNA，故突變細胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)可計算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。在TK基因突變試驗結果觀察中可發(fā)現(xiàn)兩類明顯不同集落，即大/小集落(L5178Y細胞)或正常生長/緩慢生長集落(TK6細胞)，有研究表明，大集落/正常生長集落主要由點突變或較小范圍的缺失等引起，而小集落/緩慢生長集落主要由較大范圍的染色體畸變，或由涉及調(diào)控細胞增殖的基因缺失引起。

北京匯智泰康醫(yī)藥技術有限公司針對小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗開發(fā)染TK基因突變試劑盒，本試劑盒針對小鼠淋巴瘤細胞L5178Y開展TK基因突變試驗，試劑盒省去了陽性底物成分、篩選培養(yǎng)基準備、誘導 S9 制備，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質量檢測，無雜菌污染，誘導 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現(xiàn)性高。染色體畸變試驗試劑盒應用廣泛，可進行食品、化學品、農(nóng)藥、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。

TK基因突變試驗導則

1  范圍

本標準規(guī)定了體外哺乳類胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突變試驗的基本試驗方法與技術要求。

本標準適用于評價受試物的致突變作用術語和定義TK基因哺乳類動物的胸苷激基因。

2  術語和定義

2.1  TK基因

人類的TK基因定位于17號染色體長臂遠端；小鼠的則定位于號染色體。

2.2  突變頻率

在某種細胞系中，某一特定基因突變型的細胞(集落)占細胞(集落)總數(shù)的比例(單位通常為10^-6)。

3  原理

TK基因突變試驗的檢測終點是TK基因的突變。TK基因突變屬于常染色體基因突變。

TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反應。在正常情況下，此反應并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應生成TMP。但如在細胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進而摻入DNA，造成致死性突變,故細胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻DNA，故突變細胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)可計算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。在TK基因突變試驗結果觀察中可發(fā)現(xiàn)兩類明顯不同集落，即大/小集落(L5178Y細胞)或正常生長/緩慢生長集落(TK6細胞)，有研究表明，大集落/正常生長集落主要由點突變或較小范圍的缺失等引起，而小集落/緩慢生長集落主要由較大范圍的染色體畸變，或由涉及調(diào)控細胞增殖的基因缺失引起。

4  儀器和設備

   培養(yǎng)箱、恒溫水浴、二氧化碳培養(yǎng)箱、壓力蒸汽消毒器、、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、生物安全柜、倒置顯微鏡、離心機、無菌細胞培養(yǎng)瓶，玻璃器皿等。

5  培養(yǎng)基

5.1  *培養(yǎng)基

RPMI1640培養(yǎng)液，加入10%馬血清(培養(yǎng)瓶培養(yǎng))或20%馬血清(96孔板培養(yǎng))及適量抗菌素(青霉素、鏈霉素的終濃度分別為100IU/mL及100μg/mL。

5.2  THMG和TMG選擇培養(yǎng)基THMG培養(yǎng)基

THMG培養(yǎng)基：3μg/mL胸腺嘧啶核苷( thymidine,T)+5μg/mL次黃嘌呤( hypoxanthine,H)+0.1μg/mL氨甲喋昤( methotrexate,M)+7.5μg/mL甘氨酸( glycine,G)。

THG培養(yǎng)基：3μg/mL胸腺嘧啶核苷(T)+5μg/mL次黃嘌昤(H)+7.5μg/mL甘氨酸(G)。

以上濃度為各試劑在培養(yǎng)基中的終濃度。實際試驗中,常按照表1的方法把THMG和THG配成100倍濃度，在試劑盒中即為100倍濃度。

6  試驗方法

6.1  細胞和培養(yǎng)條件

TK^+/-型的L5178Y-3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞或TK6人類淋巴母細胞。

兩種細胞均在5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下作常規(guī)懸浮培養(yǎng)。

為避免在培養(yǎng)和傳代期間自發(fā)突變的細胞對試驗結果的影響，在正式試驗前，應清除自發(fā)突變的TK^-/-基因型細胞。方法是：

a) 對于L5178Y細胞，使用THMG培養(yǎng)基處理24h，以800r/min~1000r/minm的速度離心4~6min、洗滌后在不含氨甲喋呤的THG培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d；

b) 對于TK6細胞,使用CHAT培養(yǎng)基處理48h，以800r/min~1000r/min的速度離心4~6min、洗滌后在不含氨基喋呤的CHT培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3d。

6.2  受試物

6.2.1  受試物的配制

固體受試物應溶于或懸浮于適當?shù)娜軇┗蛸x形劑中，在處理細胞前適當稀釋。液體受試物可直接加至試驗系統(tǒng)和或于染毒前稀釋。應該使用新鮮制備的受試物，除非穩(wěn)定性資料證實可以貯存。

6.2.2  受試物劑量設定

至少應設置3個~4個可供分析的濃度。對于有細胞毒性的受試物，應根據(jù)細胞毒性預試驗結果在RS或RSG為20%~80%范圍內(nèi)設3個~4個劑量(濃度)水平，同時應該考慮受試物對溶解度、pH和摩爾滲透壓濃度的影響。方法是：取生長良好的細胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL,按1%體積加入不同濃度受試物，37℃震搖處理3h(L5178Y細胞)或4h(TK6細胞)，細胞經(jīng)離心洗滌后，作2d(L5178Y細胞)或3d(TK6細胞)表達培養(yǎng)，每天計數(shù)細胞密度并計算相對懸浮生長(RSG)?；蛉∩鲜鎏幚砗蠹毎麘乙海魈荻认♂屩?個細胞/mL，接種96孔板(每孔加0.2mL,即平均1,6個細胞/孔),每個劑量種1塊~2塊平板,，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)，計算相對存活率(RS)。

對于細胞毒性極低的受試物，gao濃度應設為5mg/ mL、5uL/mL或0.01mol/L.。對于相對不溶解的物質，其gao濃度的設置應達到不影響細胞培養(yǎng)的大可加入濃度。

6.2.3  對照

一般情況下，每一項試驗中，在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在的條件下均應設陽性和陰性(溶媒)對照瓶組。

當使用代謝活化系統(tǒng)時，陽性對照物應使用要求代謝活化、并能引起典型突變集落的物質，可以使用3-甲基膽(3- methyleholanthrene)、環(huán)磷酰胺( cyclophosphamide,CP)等。在沒有代謝活化系統(tǒng)時陽性對照物可使用甲基磺酸甲酯( methyl methane sulfonate,MMS)、絲裂莓素C( mitomycin C,MMC)、甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulfonate,EMS)等使用其他適宜的陽性對照物。

溶媒應是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學反應，不影響細胞存活和S9活性。溶媒首先選擇蒸餾水，如使用非水溶媒（可選擇二甲基亞砜、丙酮、乙醇等），則需增設溶媒對照。

6.3  處理

取生長良好的細胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL，按1%體積加入受試物(需代謝活化的情況下，同時加終濃度為10%的S9混合物)，37℃振搖處理3h（L5178Y細胞）或4h(TK6細胞)，以800~100r/min的速度離心4min-6min，棄上清液，用PBS或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2遍，重新懸浮細胞于含10%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細胞密度為2×10⁵/mL。

6.4  PE₀（0d的平板接種效率）測定

取適量細胞懸液，作梯度稀釋至8個細胞/mL，接種96孔板(每孔加0.2mL，即平均1.6個細胞/孔)，每個劑量種1塊~2塊平板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d。計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。

6.5  表達

取6.3所得細胞懸液，作2d(1L5178Y細胞)或3d(TK6細胞)表達培養(yǎng)，每天計數(shù)細胞密度并保持密度在10⁶/mL以下，計算相對懸浮生長(RSG)。

6.6  PE₂(L5178Y細胞)或PE₃ (TK6細胞)測定

表達培養(yǎng)結束后,取適量細胞懸液,按6.4方法測定PE₂/ PE₃。

6.7  突變頻率（MF）測定

6.7.1  L5178Y細胞

L5178Y細胞表達培養(yǎng)2d后，取適量細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×10⁴/mL，加人TFT(終濃度為3ug/mL.)，混勻，接種96孔板(每孔加0.2mL，即平均2000個細胞/孔)，每個劑量作2塊~4塊板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)。突變集落按大集落Large Colony,LC：直徑≥1/4孔徑，密度低)和小集落(small colony，SC：直徑<1/4孔徑，密度高)分別計數(shù)。極小集落可再繼續(xù)培養(yǎng)3d后計數(shù).

7  大鼠肝微粒體酶的誘導和S₉的制備

7.1  誘導

廣泛應用的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導劑，劑量為500mg/kg體重。誘導劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴bi妥鈉和β-萘黃酮結合也可做為誘導劑。

•  S₉制備

動物誘導后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化甲溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化甲溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化甲溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S₉）分裝于塑料管中。每管裝2 mL ~3 mL。儲存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S₉所用一切手術器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S₉制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。大鼠肝微粒體肝S9制備過程時間較久，也可以直接聯(lián)系北京匯智泰康購買現(xiàn)有肝微粒體，肝S9，NADPH再生系統(tǒng)，UGT孵育系統(tǒng)等產(chǎn)品。

8  數(shù)據(jù)處理和結果評價

8.1  數(shù)據(jù)處理

8.1.1  平板效率（PE₀、PE₂）

其中，EW為無集落孔數(shù)，TW為總的孔數(shù)，1.6為每孔接種細胞數(shù)。

8.1.2  相對存活率（RS）：

8.1.3  相對懸浮生長（RSG）每日細胞增長率（DGG）：

8.1.4  相對懸浮生長（RSG）

8.1.5  相對總生長（relative total growth，RTG）

其中，RSn 第2天（L5178Y細胞）的相對存活率。

8.1.6  突變頻率（MF）

其中，EW——96孔板無集落孔數(shù)；

TW——96孔板總的孔數(shù)；

N——每孔接種細胞數(shù)（此處N=2000），

PE2——第2天L5178Y細胞的平板效率。

此外，對于L5178Y細胞，可分別計算大集落突變率(L-MF)、小集落突變頻率(S-MF)和總突變頻率(T-MF)。對于TK6細胞，可分別計算正常集落突變頻率(N-MF)，緩慢生長集落突變頻率S-MF)和總突變頻率(T-MF)。

8.1.7  小集落突變百分率

8.2  結果評價

8.2.1  試驗成立條件

試驗所用L5178Y細胞的自發(fā)突変頻率應在50X10^-6~200X10^-6之間；TK6細胞的自發(fā)突變頻率應在1.5X10^-6~5.5X10^-6之間，同時自發(fā)突變頻率應在本實驗室歷史記錄范圍內(nèi)。陰性/溶媒對照的PE₀在60%~140%之間，PE₂/ PE₃的值在70%~130%之間。陽性對照的T-MF與陰性/溶媒對照有顯著差異，或是陰性/溶媒對照3倍以上。

8.2.2  受試物陽性和陰性結果的判定

與陰性照組相比較，在所有染毒條件下，一個或多個劑量水平上基因突變頻率差值超過126.0×10-6（總評價因子，GEF）。

試驗樣品所誘發(fā)的基因突變頻率出現(xiàn)濃度依賴性的增加。 

結果同時滿足上述標準，判定為陽性結果；否則，判定為陰性結果

•  試驗的解釋

TK基因突變試驗具有較高的敏感性，可檢出包括點突變、大的缺失、重組、異倍體和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的多種遺傳改變，長時間處理還可檢出某些斷裂劑、紡錘體毒物和多倍體誘導劑等。但體外試驗不能*模擬哺乳動物體內(nèi)代謝條件，因此，本試驗結果不能直接外推到哺乳動物。陽性結果表明受試樣品在該試驗條件下可引起所用哺乳類細胞基因突變；陰性結果表明在該試驗條件下受試樣品不引起所用哺乳類細胞基因突變。評價時應綜合考慮生物學意義和統(tǒng)計學意義。
匯智泰康TK基因突變試劑盒優(yōu)勢
北京匯智泰康醫(yī)藥技術有限公司針對小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗開發(fā)染TK基因突變試劑盒。

便捷—— 本試劑盒省去了誘導 S9 制備，陽性底物、篩選培養(yǎng)基的配制和濃度條件摸索的時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。 準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質量檢測，無雜菌污染，誘導 S9 活性均符合L5178Y細胞基因突變試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。

常見問題及原因分析
1、細胞自發(fā)突變范圍不在5010^-6~20010^-6之間：需要再做一次細胞自發(fā)突變清除，直至自發(fā)突變在 5010^-6~20010^-6
2、工作量較大：可以將有代謝活化和無代謝活化試驗分開進行，減小工作量，確保試驗準確性。

TK基因突變試劑盒使用說明書

【試驗原理】

TK基因突變試驗的檢測終點是TK基因的突變。在細胞培養(yǎng)物中加入三氟胸苷（TFT），則TFT在胸苷激酶的催化下生成三氟胸苷酸，進而參入DNA，造成致死性突變，細胞不能存活；若TK基因發(fā)生突變，導致細胞胸苷激酶（TK）缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，突變細胞表現(xiàn)出對TFT抗性，在TFT存在條件下仍能生長。在有或無代謝活化的條件下，將細胞培養(yǎng)物暴露于受試物適當時間，經(jīng)適當?shù)呐囵B(yǎng)時間，計數(shù)集落，計算突變頻率，從而推斷受試物致突變性。

【產(chǎn)品說明】

匯智泰康TK基因突變試劑盒提供進行體外哺乳動物細胞TK基因突變試驗所需的主要試劑和細胞，可用于評價受試物的致突變作用。其中所用細胞和試劑均符合國標要求，且在國標的基礎上引入了MTT染色法，使的結果觀察更為直觀，為實驗結果的可靠性提供了支持。

【產(chǎn)品使用說明】

1、細胞復蘇

從-70冰箱取出細胞，于37℃水浴融化，1000rpm離心5min，棄上清，用含10%馬血清、0.2mg/mL丙酮酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-10）中重懸細胞；1000rpm再次離心5min，棄上清，用RPMI-10重懸后接種于細胞瓶中培養(yǎng)。

2、自發(fā)突變細胞清除

取對數(shù)生長期細胞懸液，于含1% 的THMG（100×）的*培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，1000 r/min離心5 min，洗滌后于含1%的THG（100×）*培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

注：為確保試驗的可行性，試驗中所用細胞的自發(fā)突變率應在5010^-6~20010^-6之間，清除自發(fā)突變的細胞傳代使用不得超過1個月，每次試驗前需將細胞清除自發(fā)突變。

3、染毒處理

取生長良好的細胞，調(diào)整細胞密度為5×10⁵個/mL（細胞數(shù)可根據(jù)實驗室情況做調(diào)整），在加或不加代謝活化系統(tǒng)的條件下，按1%的體積加入不同濃度的受試物，37℃，70 rpm/min染毒處理3h，每個試驗組平行處理兩份培養(yǎng)物。

（1）S9混合液及染毒用細胞液配制

注：在試驗過程中，需根據(jù)實際需求，調(diào)整配制量。

（2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案（以4個受試物劑量組為例）

注：染毒時間可根據(jù)實際情況進行調(diào)整，一般為3h~6h，必要時可延長到1個或多個細胞周期。若需進行24小時染毒，所用陽性底物需稀釋3倍后再加入。

4、表達培養(yǎng)

染毒細胞經(jīng)離心洗滌后，重懸細于RPMI-10培養(yǎng)液中，于在細胞培養(yǎng)瓶中表達培養(yǎng)2 d。每天測定細胞密度，計算懸浮生長（SG）、相對懸浮生長（RSG）和細胞相對總生長（RTG），具體方法可參照國標方法要求。

5、突變頻率測定

表達培養(yǎng)2天后，用含20%馬血清、0.2mg/mL丙酮酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-20）重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10⁴個/mL，加入TFT（終濃度3 μg/mL），混勻，0.2mL/孔接種96孔板（即2000個細胞/孔），于37℃、5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，10μL/孔加入MTT染色劑，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中放置2~4h，計數(shù)每塊平板有大集落LC和小集落SC生長的孔數(shù)。試驗樣品處理組和陽性對照組每份培養(yǎng)物各設2個重復；陰性溶媒對照組設4個重復。

6、數(shù)據(jù)處理和結果評價

數(shù)據(jù)處理方法和結果判定可參照：476 體外哺乳動物細胞基因突變試驗，化學品測試方法健康效應卷（第二版），中國環(huán)境出版社，2013年（ISBN：978-7-5111-1476-1）；OECD 490等。

注：在染毒處理和表達培養(yǎng)結束后，均需對平板接種效率進行測定，且要保證PE在70%~130之間，具體可參照國標方法進行。

【注意事項】

1.實驗前請自行準備RPMI 1640培養(yǎng)液、馬血清、丙酮酸鈉、細胞培養(yǎng)瓶、96孔細胞培養(yǎng)板、滅菌槍頭、無菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱、振蕩器、50mL離心管等，所有耗材需做無菌處理。

2.實驗操作應在符合細胞培養(yǎng)實驗要求的環(huán)境下進行。

3.細胞清除自發(fā)的突變使用的血清建議與正式試驗血清同一廠家同一批號。

4.實驗過程中注意細胞計數(shù)的準確性。